Перш ніж почати обробку проби сперми , слід дочекатися її розрідження, яке вимагає простий 30-хвилинної інкубації при кімнатній температурі.
Потім сперматозоїди необхідно відмити, так як насіннєва плазма, навіть в невеликих кількостях, може бути токсичною як для них, так і для яйцеклітин.
Крім того, в спермі можуть бути присутніми бактерії, які при попаданні в жіночі статеві шляхи або навіть при інсемінації in vitro здатні пролиферировать і викликати запалення.
Насіннєва плазма містить велику кількість простагландинів, які при попаданні в порожнину матки можуть викликати пароксизмальні і хворобливі скорочення міометрія. Обробка сперми передбачає не тільки відділення сперматозоїдів від насінної плазми, але і збільшення частки клітин, що володіють високою рухливістю і нормальною будовою, а також індукцію процесу капацитации.
Нещодавно були запропоновані методи відбору сперматозоїдів з певними генетичними особливостями (наприклад, що містять тільки Х-або тільки Y-хромосому), що дозволяє запобігти захворюванням, зчеплені з статевими хромосомами.
Різні методи підготовки сперматозоїдів можна розділити на чотири групи відповідно до використовуваних фізичними принципами:
- фільтрація,
- флотация,
- центрифугування в градієнті щільності,
- проточна цитометрії.
Більшість методів включає початкове розрідження сперми (в умовах простий інкубації) і подальше відділення містить сперматозоїди фракції від насіннєвої плазми шляхом центрифугування. Супернатант викидають, а далі застосовують одну з перерахованих процедур.
Фільтрація
Фільтрація сперматозоїдів на колонці зі скляною ватою або скляними гранулами набула широкого поширення. Суспензію сперматозоїдів, звільнених від насіннєвої плазми, наносять на вертикальну колонку, заповнену або 15 мг скляної вати (112-го розміру мікроволокон), або 1 г скляних гранул (діаметром 75-150 мкм кожен). Перед нанесенням суспензії сперматозоїдів колонку промивають культуральної середовищем, щоб видалити потенційно токсичні речовини і врівноважити її вміст.
Суспензія сперматозоїдів стікає вниз, і фракцію високорухливих клітин можна зібрати по краплях і використовувати для штучного запліднення. Нерухомі сперматозоїди, лейкоцити і круглі клітини зазвичай прилипають до скла або затримуються на фільтрі, тоді як рухомі клітини легко проходять через колонку.
Фільтрація забезпечує швидкий і високий вихід рухливих сперматозоїдів. В цьому відношенні вона не менш ефективна, ніж флотация або центрифугування в градієнті щільності. В процесі фільтрації втрачається, мабуть, не багато клітин, а сама процедура нетривала (10 хвилин). При ЕКО відфільтровані сперматозоїди настільки ж ефективні, що і клітини, отримані шляхом флотації.
Основний недолік методу фільтрації (особливо при використанні скляної вати) — мінливість відстаней між волокнами і в силу цього варіабельність результатів.
Флотация
Сперматозоїди для штучного запліднення найчастіше отримують методом флотації, який заснований на тому, що самі рухливі і повноцінні клітини мають здатність спливати проти сили тяжіння в верхній шар культурального середовища. Фракцію високорухливих сперматозоїдів, що не містить ні насіннєвий плази, ні лейкоцитів, можна зібрати через 60-90 хвилин.
Значення цього методу тим більше велика, що для проникнення сперматозоїдів в супернатант клітинам необхідні ті ж властивості, що і для проникнення в шеечную слиз і запліднення яйцеклітин. Тому результати штучного запліднення корелюють з концентрацією спливли сперматозоїдів. Всупереч попереднім повідомленням, метод флотації не гарантує відбору клітин, що містять тільки Y-хромосому.
Основний недолік цього методу — малий вихід рухливих сперматозоїдів, особливо при вираженій патології сперми. Вихід клітин можна підвищити шляхом збільшення часу інкубації, легкого струшування пробірки з культурою клітин і використання відразу декількох паралельних проб (так звана «многопробірочний спосіб»).
Проте методом флотації можна отримати більш рухливі сперматозоїди і відносно більшу кількість нормальних клітин, ніж методами центрифугування в градієнті щільності і фільтрації. Згідно з даними одного проспективного контрольованого дослідження, результати ЕКО практично не залежать від способу обробки сперматозоїдів.
Хоча метод флотації вимагає щодо великих витрат часу, він технічно простий, не потребує складного лабораторному устаткуванні і в руках різних лаборантів дає однакові результати .
Центрифугування в градієнті щільності
Цим методом рухливі і нормальні сперматозоїди відокремлюються не тільки за рахунок швидкості обертання центрифуги, а й в силу свого частки. Відомо, що життєздатні сперматозоїди за питомою вагою відрізняються від дегенерувати або мертвих.
Промиту суспензію сперматозоїдів наносять на колонку, що містить кілька шарів колоїдної рідини різної щільності і потім центрифугують. Для цієї мети можна використовувати Перколла з колоїдними силіконовими частинками діаметром 15-30 нм. Частинки покривають біологічно інертним полівінілпіролідоном (Уппсала, Швеція).
Центрифугування в градієнті щільності відокремлює живі сперматозоїди не тільки від мертвих, але і від лейкоцитів. Запропоновано різні модифікації і склади розчинів, що містять колоїдні частинки: безперервні градієнти щільності, ступінчасті градієнти щільності і ступінчасті градієнти щільності в малому обсязі (міні-Перколла). Безперервний градієнт щільності вимагає ультрацентрифугирования (& gt, 100 000 g), яке краще розділяє частки невеликого розміру, такі, як віруси і мітохондрії.
Тому для поділу сперматозоїдів, що мають відносно великі розміри, використовують переважно ступінчастий градієнт щільності. Фракція, збагачена рухливими сперматозоїдами, легко виявляється у вигляді каламутній смуги в області між 85% і 100% суспензією Перколла. При дуже поганій якості сперматозоїдів і дуже малому їх кількості доцільно використовувати міні-колонку з Перколла, так як для цього потрібно всього 0,9 мл рідини.
Вихід рухливих сперматозоїдів при центрифугировании в градієнті щільності більше, ніж при використанні методу флотації, але дані про вплив того чи іншого з цих методів на результати звичайного ЕКЗ суперечливі. У контрольованому проспективному дослідженні не було виявлено різниці в частоті запліднення при використанні різних методів обробки сперматозоїдів.
Однак, за даними іншого контрольованого дослідження, частота запліднення після центрифугування сперматозоїдів в градієнті щільності виявилася набагато більшою, ніж після флотації. У будь-якому випадку результати штучного запліднення більше залежать від стану фертильності обох партнерів, ніж від методів обробки сперматозоїдів.
Центрифугування в градієнті щільності вимагає менше часу (20 хвилин), ніж метод флотації (мінімум 60 хвилин) і не виділяє сперматозоїди , що містять переважно Y-хромосому. Немає ніякого ризику і запалення жіночих статевих шляхів внаслідок попадання в них колоїдних силіконових часток при інсемінації. Перколла може бути забруднене ендотоксинами, але в даний час існують і інші системи.
Відбір сперматозоїдів за допомогою проточної цитометрії
Одночасно з преимплантационной діагностикою все більший інтерес привертає можливість профілактики спадкових захворювань шляхом відбору сперматозоїдів з певними генетичними властивостями. Перший етап зводиться до виділення сперматозоїдів з Y-хромосомою, що дозволяє запобігти зчеплені з Х-хромосомою хвороби ще до запліднення.
У ряді випадків причиною повторних викиднів служить аномально велику кількість диплоїдних сперматозоїдів. У цій ситуації поділ диплоїдних і гаплоїдний клітин перед інсемінацією і заплідненням має запобігти аборт. Такий поділ здійснюють за допомогою проточної цитометрії та відбору сперматозоїдів, попередньо мічених флуоресцентним барвником, що дозволяє розрізнити клітини з різною кількістю ДНК в геномі. Так, зміст ДНК в сперматозоїдах з Х-хромосомою приблизно на 3% більше, ніж в клітинах з Y-хромосомою.
Проточная цитометрия дає можливість досить швидко зібрати ту кількість сперматозоїдів, яке необхідно для штучного запліднення. За допомогою цього методу (використовуваного головним чином для запобігання зчеплених з Х-хромосомою генетичних захворювань) вдавалося індукувати вагітності шляхом ВМО, звичайного ЕКЗ і ІКСІ.
Хоча застосування даного методу пов'язане з впливом на стать дитини, в найближчому майбутньому він може придбати найважливіше значення для профілактики вроджених захворювань. Результати численних дослідів на тваринах свідчать про те, що флуоресцентні барвники не ушкоджують структуру ДНК.
Обробка сперматозоїдів для ІКСІ
При різко вираженою оліго- астено-тератом-зоосперміі або при отриманні сперматозоїдів з придатка яєчка (MESA) для обробки цих клітин можна використовувати градієнт щільності в малому обсязі, наприклад, міні-Перколла. Найчастіше для ІКСІ вдається отримати лише окремі рухливі сперматозоїди без надійного їх відбору.
У цих випадках для очищення проби від домішок досить просто промити осад після центрифугування, видалити супернатант і знову приготувати суспензію сперматозоїдів в середовищі.
Щоб полегшити захоплення рухомого сперматозоїда мікропіпеткою, в'язкість середовища можна збільшити, додавши в неї велика кількість біологічно інертного полівінілпіролідону (8 г / 100 мл середовища) з мовляв. масою 360 тис. кДа. Це з'єднання при його можливе потрапляння в яйцеклітина не має будь-яким мутагенну дію.
Для ІКСІ можна використовувати і нерухомі, але життєздатні сперматозоїди. Життєздатність таких клітин оцінюють по набухання в гіпоосмотіческая середовищі. Сперматозоїди инкубируют в культуральному середовищі, заздалегідь розведеної рівним об'ємом дистильованої води. Живі клітини реагують при цьому типовим набуханием хвоста. Перед ІКСІ їх переносять мікропіпеткою в вихідне середовище, де вони відновлюють свій обсяг.
Обробка сперматозоїдів в культурі
Результати штучного запліднення покращує не тільки відбір повноцінних сперматозоїдів, але і модифікація складу культурального середовища .
Для стимуляції рухливості клітин в середу додають різні хімічні речовини: 2-дезоксиаденозин, пентоксифілін і кофеїн. Ці речовини пригнічують фосфодіестеразу, приводячи до збільшення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ.
Після додавання будь-якого з них до насіннєвий плазмі або до середовища рухливість, швидкість і ступінь гіперактивації сперматозоїдів значно зростають, але, незважаючи на виразні зміни рухливості клітин, частота запліднення і вагітностей не збільшується. Крім того, по крайней мере для кофеїну, показана дозозалежна ембріотоксичність.
Функцію сперматозоїдів можна підвищити не тільки додаванням певних хімічних речовин, але і спільним культивуванням з епітеліальними клітинами. Дійсно, у тварин різних видів на функцію сперматозоїдів впливає прямий контакт з клітинами слизової маткової труби.
Експериментальні дані свідчать про зростання рухливості і ступеня гіперактивації сперматозоїдів при їх спільному культивуванні з різними клітинами. Вплив спільного культивування сперматозоїдів з іншими клітинами на результати штучного запліднення поки не встановлено.
При звичайному ЕКО сперматозоїди протягом ночі залишаються в контакті з клітинами яйценосного горбка і радіальної корони, що може імітувати позитивний ефект спільного культивування.
