Планування і інтерпретація результатів токсикологічних досліджень на репродуктивну функцію у чоловіків
Планування експериментальних досліджень
Значення експериментальних досліджень в кінцевому рахунку залежить від того, наскільки вони сприяють розумінню токсикології людини. З одного боку, в експерименті дію будь-якого фактора можна ретельно проконтролювати, отримуючи при цьому відтворюються дані, але з іншого — завжди залишаються сумніви з приводу можливості екстраполяції отриманих даних на людину. Для виключення впливів невідомих чинників і оцінки дії лише відомих необхідна рандомизация об'єктів дослідження в контрольних і піддослідних групах. Потрібно також неодноразове і точне відтворення спостережуваних ефектів. При інтерпретації отриманих даних необхідно строго враховувати можливість видових відмінностей у ставленні шляхів надходження, розподілу, метаболізму, екскреції і механізму дії досліджуваного фактора.
Планування спостережень на людину
Токсикологія людини користується зазвичай даними ретроспективних епідеміологічних або клінічних досліджень . Дія шкідливих речовин при цьому не контролюється, і виокремити їх роль серед безлічі привхідних факторів буває важко або навіть неможливо. Основне джерело помилок в дослідженнях людини, особливо потребують збору проб сперми, — контингент обстежуваних . Хоча в останні роки ставлення до здачі сперми змінюється, більшість людей неохоче беруть участь в такого роду дослідженнях, якщо тільки у них немає проблем з фертильністю. Група піддослідних складається мимовільно, що неминуче вносить у дослідження непоправну помилку. Про ефект досліджуваного фактора судять на підставі історії хвороби, результатів фізикального обстеження і аналізів крові або сперми. При цьому отримують відомості про розміри яєчок, параметрах сперми (обсязі еякуляту, кількості сперматозоїдів, рухливості і інших спеціальних показниках їх функції) і про концентрацію ФСГ в крові. Особливо корисні серійні дослідження, що дозволяють виявити індивідуальні відмінності багатьох таких параметрів. У тих випадках, коли серійні дослідження неможливі, певні вказівки на можливість токсичного ефекту дає порівняння індивідуальних показників з межами норми.
Нормативна перевірка токсичності щодо репродуктивної системи
Нормативи дослідження репродуктивної функції
З точки зору нормування, хімічні речовини поділяються на харчові, фармакологічні і потрапляють у зовнішнє середовище. Перші включають харчові добавки та пакувальні матеріали, дотичні з харчовими продуктами. До других відносяться лікарські засоби і сполуки, які використовуються в медицині і ветеринарії, а до третіх — будь-які речовини, застосування яких супроводжується їх потраплянням в навколишнє середовище. До величезного розмаїття речовин і способів їх застосування, з якими доводиться мати справу незалежним контролюючим організаціям, додається відмінність підходів до оцінки ефектів конкретних речовин в різних країнах. Необхідність уніфікації показників безпеки хімічних сполук, що застосовуються в усьому світі, зумовила прийняття угоди між Європейським співтовариством, США і Японією за загальними підходами до оцінки токсичності лікарських препаратів. В даний час Міжнародний Комітет з узгодження технічних вимог до реєстрації фармакопрепаратов для людини розробив єдині правила, схвалені контролюючими організаціями кожного регіону.
Базуючись на «трехкомпонентном» плані, вперше запропонованому в 1966 р Управлінням з контролю за якістю харчових продуктів, медикаментів і косметичних засобів США (FDA), ці правила вимагають дослідження фертильності самців і самок щурів, пре- і постнатального дослідження посліду самок щурів і дослідження тератогенного дії на щурах і будь-якому ще одному виді ссавців. Про прямому вплив на чоловічу репродуктивну систему дозволяє судити лише перший компонент плану, але для встановлення безпечних доз проводять попередні дослідження, що дають відомості про гістології яєчок, рухливості і життєздатності сперматозоїдів. У тих випадках, коли такі дослідження не виявляють змін, оцінка фертильності не вимагає подальшого вивчення параметрів сперми. Слід підкреслити, що розроблені Комітетом правила вперше рекомендують спеціально досліджувати вплив нових хімічних речовин на чоловічу статеву функцію.
Харчові і потрапляють у зовнішнє середовище хімічні речовини контролюються FDA і Управлінням по захисту навколишнього середовища, відповідно, в США, Організацією з економічного співробітництва та розвитку в Європі і Міністерством сільського господарства, рибної та харчової промисловості в Японії. Всі ці органи пред'являють практично однакові вимоги до випробування таких речовин, що включають:
- тератологічні дослідження на двох видах тварин
- дослідження токсичності на одному поколінні
- дослідження токсичності на двох поколіннях
В даний час потрібно також дослідження гістології яєчок і сперми особин обох поколінь.
Згідно з директивою 93/21 ЄЕС Європейського Союзу (додаток до директиви Ради за класифікацією, пакування та маркування небезпечних речовин, 67/548 ЄЕС), токсичні для репродуктивної системи речовини діляться на три категорії з обов'язковим зазначенням ризику (маркування «R60? або« R61?) або можливого ризику ( «R62 ?,« R63?) щодо фертильності або новонароджених, відповідно, або ризику для грудних дітей ( «64?) . Таке маркування відображає сучасні уявлення про ступінь небезпеки для репродукції будь-якої речовини, дії якого піддається населення Європи.
Методи дослідження чоловічої репродуктивної системи в експерименті
Для контролю токсичності щодо репродуктивної функції все частіше застосовуються методи фундаментальних досліджень . Крім уже широко застосовуваних методів, до них відносяться:
- докладний гістологічне вивчення зародкового епітелію,
- упізнання характерних клітинних асоціацій і стадій розвитку,
- проточна цитометрії, що дозволяє оцінити загальну кількість сперматозоїдів і частку гаплоидних, диплоїдних і тетраплоїдних клітин в яєчках,
- вітальне фарбування для визначення кількості клітин з інтактною мембраною (показник життєздатності),
- комп'ютерні методики для об'єктивної оцінки рухливості сперматозоїдів.
Для виявлення потенційно успадкованих генетичних мутацій в ДНК зародкових клітин запропоновані також різні методи визначення генотоксичности in vivo . Вони включають тести на домінантні летальні мутації, успадковані транслокации і анеуплоідіі. Чекають свого застосування і інші методи, наприклад, стереологіческая оцінка кількості зародкових клітин і генетичне вивчення зародкового епітелію.
Важливо підкреслити, що не існує якогось одного методу або показника, які дозволяли б оцінити загальну токсичність для чоловічої репродуктивної системи.
Критерії оцінки токсикологічних даних, отриманих під час спостережень на людину
Рішення контролюючих органів щодо безпеки тих чи речовин для людини вимагають складних оцінок ризику. Такі оцінки визначаються сукупністю результатів, отриманих в ході спостережень на людях (а такі спостереження зазвичай проводяться без контролю і мають ретроспективний і описовий характер), і контрольованих лабораторних досліджень на тваринах, клітинах і системах in vitro . Перші позбавлені необхідної наукової строгості, оскільки не враховують можливу роль привходящих факторів. Дані про вплив багатьох нових хімічних речовин на людину повністю відсутні, і доводиться покладатися тільки на лабораторні випробування. В інших випадках існують групи людей, що піддаються дії лікарських препаратів або професійних шкідливих умов (на виробництві або в побуті), і при обстеженні таких груп можна отримати важливі, хоча і обмежені відомості.
Контрольовані дослідження на здорових людях можливі лише в дуже рідкісних випадках, головним чином при перевірці лікарських засобів, що мають мінімальну токсичність. За цим винятком, найкращим способом отримання надійних даних про вплив хімічних речовин на репродуктивну систему людини залишається одночасне обстеження здорових людей, що піддаються впливам відповідних речовин за умовами роботи, і не відчувають їхнього впливу (контрольні групи). Інтерпретація результатів таких досліджень чревата неминучими помилками, пов'язаними з відсутністю рандомізації, незгодою на участь в дослідженні (аналогія з «ефектом здорового робочого»), а також з кількісної недостатністю і вибірковістю обстежуваних груп (особливо контрольної).
Необхідність аналізу сперми — основна і майже непереборна складність, з якою стикаються такого роду польові дослідження на людях. Як правило, на це погоджуються лише ті, хто і раніше турбувався з приводу своєї фертильності і / або побоюється токсичного впливу. Для контрольних груп на виробництві показник участі в дослідженні зазвичай не перевищує 10-20%, і це служить джерелом неминучих помилок.
Перспективи досліджень
Досліди на тваринах
Гіпотеза, згідно з якою вплив гормонально-активних хімічних сполук у внутрішньоутробному періоді позначається на майбутній репродуктивної здатності, потребує подальшої експериментальної перевірки. У дослідах на гризунах неодноразово зазначалося, що вплив ксеноестрогенів в пре- або неонатальному періоді змінює репродуктивну функцію самців, але не менш часто такого ефекту спостерігати не вдавалося. Найважливіше значення для майбутніх досліджень повинна мати відтворюваність ефектів, причому дози повинні бути порівнянними з тими, які можуть діяти на людину. Не менш важливо оцінювати можливість перенесення на людину даних, отриманих в дослідах на тваринах. Вся експериментальна токсикологія повинна будуватися з урахуванням міжвидових відмінностей. Реальні або уявні небезпеки для репродукції все більш привертають увагу громадськості. Тому вкрай актуальні пошуки показників, краще відображають можливу токсичність щодо статевої функції. Необхідно розвивати дослідження хронічної дії малих доз, яке більше відповідає реальним умовам життя людини.
Розуміння механізмів індукції мутацій в чоловічих зародкових клітинах дозволяє сподіватися на прогрес в з'ясуванні відповідних ефектів окремих факторів. Для цього необхідно розробити стратегію спеціальних досліджень.
Спостереження на людину
Зростаюча тривога з приводу шкідливого впливу багатьох хімічних речовин на чоловічу репродуктивну функцію повинна послужити стимулом подальшого розвитку репродуктивної токсикології людини. Раннього виявлення загрозливих репродукції факторів сприятиме більш систематичний збір даних про стан репродуктивної функції серед робітників, що піддаються і не піддаються дії таких чинників, а також більш широке тестування нових лікарських засобів перед їх реєстрацією. Це могло б призвести до зменшення частки випадків чоловічого безпліддя невідомого генезу.
Стандартні методи аналізу еякуляту (як в клінічних, так і в дослідницьких цілях) викладені в 4-му виданні Лабораторного керівництва ВООЗ з вивчення сперми людини і взаємодії сперматозоїдів з шєєчной слизом. Ці рекомендації отримали загальне схвалення. Використання програм контролю якості аналізів сперми все більше зменшує розбіжність результатів всередині окремих лабораторій і між ними. Дані, отримані при обстеженні будь-якій популяції, наприклад про кількість дітей або про кількість сперматозоїдів, дуже важко трактувати за відсутності відповідної контрольної групи.
Збір даних про стан сперматозоїдів у осіб, що входять в «групи ризику», стикається з практичними труднощами, включаючи неохоче і вибіркове участь в дослідженнях (ступінь якого залежить від усвідомлення ризику), а також трактування випадкових спостережень як закономірних. Звідси випливає доцільність обліку більш непрямих показників статевої функції. Одним з них є з'ясовується шляхом анкетування «час до вагітності» (термін шлюбу до настання вагітності у дружини). Цей показник замінює раніше запропонований стандартизований коефіцієнт фертильності. Він дозволяє отримати кількісне уявлення про фертильності обстежується і оцінити вплив на фертильність виробничих та інших умов. Таким чином, збір відповідних даних безпосередньо на робочому місці (шляхом анкетування або отримання еякуляту) буде в значній мірі сприяти ранньому виявленню небезпечних впливів.